Células madre adiposas humanas disminuyen el daño de la fibrosis hepática con baja persistencia de células trasplantadas en ratas / Human adipose stem cells decrease liver fibrosis damage with low persistence of transplanted cells in rats

RESUMEN: En la enfermedad hepática crónica el trasplante ortotópico es la única alternativa terapéutica actual pero es limitada por falta de donantes. Ensayos con células madre adultas en daño hepático agudo evidencian promisorios resultados. El objetivo de este trabajo fue evaluar en ratas con daño hepático crónico la efectividad de la infusión de células madre adiposas humanas (CMAd-h). Ratas con fibrosis hepática inducida por tioacetamida fueron agrupadas en: grupo I control que no recibió tioacetamida ni células madre, grupo II recibió tioacetamida y suero fisiológico i.v., grupo III recibió tioacetamida y células madre adiposas 1 x 106/kg i.v. vía vena de la cola. La regeneración hepática histológica se evaluó por el index METAVIR, mientras las Macrophagocytus stellatus, células estrelladas a- SMA+ y células colágeno I+ por inmunohistoquímica; el daño funcional se evaluó por los niveles sanguíneos de los analitos Aspartato Aminotransferasa (AST), Alanina Aminotransferasa (ALT), Fosfatasa Alcalina (ALP), úrea y nitrógeno ureico (BUN) y hemograma. Los resultados muestran atenuación del daño estructural hepático evidenciado por disminución de los nódulos, del grado de lesión histológica en el score Metavir, y disminución de Macrophagocytus stellatus, células a-SMA+ y células colágeno tipo I+; funcionalmente hay reducción moderada de AST, ALT, urea, BUN y disminución moderada de células blancas pero efecto favorable sobre el volumen corpuscular media y la hemoglobina corpuscular media. Ocho semanas después de la infusión hay escasa población de CMAd-h en el hígado. En conclusión la infusión intravenosa de CMAd-h en ratas disminuye el daño funcional y estructural de la fibrosis hepática con escasa persistencia de CMAd-h en el parénquima hepático. A nuestro conocimiento este es el primer trabajo que evalúa el efecto de las CMAd-h en el modelo daño hepático crónico murino y la persistencia de las células trasplantadas.

SUMMARY: In chronic liver disease, orthotopic transplantation is the only current therapeutic alternative but it is limited due to lack of donors. Trials with adult stem cells in acute liver damage show promising results. The aim of this work was to evaluate the effectiveness of human adipose stem cell (h-ASC) infusion in rats with chronic liver damage. Rats with thioacetamide- induced liver fibrosis were grouped into: group I control that did not receive thioacetamide and h-ASC, group II received thioacetamide and saline i.v., group III received thioacetamide and h-ASC 1 x 106/ kg i.v. via tail vein. Histological liver regeneration was evaluated by METAVIR index, while Macrophagocytus stellatus (Kupffer cells), stellate cells a-SMA+ and collagen I+ cells by immunohistochemistry; functional damage was evaluated by blood levels of the analytes Aspartate Aminotransferase (AST), Alanine Aminotransferase (ALT), Alkaline Phosphatase (ALP), Urea and Blood Urea Nitrogen (BUN) and hemogram. The results show attenuation of structural liver damage evidenced by decreased nodules, degree of histologic injury on Metavir score, and decreased Macrophagocytus stellatus, a-SMA+ cells and type I+ collagen cells; functionally there is moderate reduction of AST, ALT, urea, BUN and moderate decrease of white cells but favorable effect on mean corpuscular volume and mean corpuscular hemoglobin. Eight weeks after infusion there is a small population of h-ASC in the liver. In conclusion, intravenous infusion of h-ASC in rats reduces functional and structural damage of hepatic fibrosis with low persistence of h- ASC in the liver parenchyma. To our knowledge this is the first work that evaluates the effect of h-SC in the model of chronic murine liver damage and the persistence of transplanted cells.

Procedimiento para el cultivo e identificación de células madre obtenidas de lipoaspirado humano con fines de investigación / Procedure for culture and identification of stem cells from human lipoaspirate for research purposes

RESUMEN Las células madre humanas nacen con la creación de la vida misma y algunas de estas permanecen durante toda la vida. Por consiguiente, se pueden hallar en tejidos adultos y utilizarlas para investigaciones a nivel básico y aplicado. Actualmente, en nuestro país existe un creciente interés en el estudio y aplicación de células madre; sin embargo, existe poco conocimiento acerca del procedimiento para su identificación. Es por ello que este artículo tiene como objetivo dar a conocer, desde un punto de vista práctico, un procedimiento para el cultivo e identificación de células madre/estromales obtenidas de lipoaspirado humano (Adipose Stem Cells) con fines de investigación, el cual incluye la caracterización a nivel de inmunofenotipo, el potencial de diferenciación celular, la expresión génica y el control de calidad del cultivo celular, que sirva de apoyo para los profesionales de la comunidad científica peruana que deseen desarrollar esta línea de investigación.

ABSTRACT Human stem cells are born with the creation of life itself and some of them remain throughout life. Therefore, they can be found in adult tissues and used for basic and applied research. Currently, in our country there is a growing interest in the study and application of stem cells; however, little is known about the identification procedure. For this reason, this study aims to present, from a practical point of view, a procedure for the culture and identification of stem/stromal cells obtained from human lipoaspirate (Adipose Stem Cells), for research purposes. This procedure includes the immunophenotype characterization, cell differentiation potential, gene expression and cell culture quality control; and will serve as support for Peruvian scientific community professionals who wish to develop this line of research.

Ultraestructura del inmunofenotipo CD44+/CD24- de una línea de células de cáncer de mama triple negativo / Ultrastructure of the CD44 + / CD24- immunophenotype of a line of triple negative breast cancer cells

RESUMEN: El cáncer de mama es la principal causa de muerte debido al cáncer en mujeres. La microscopía electrónica permite establecer características constitutivas de las células entre diferentes poblaciones celulares. Las células madre del cáncer mamario con inmunofenotipo CD44alta/CD24baja son una población de células intratumorales asociada a la quimioresistencia y metástasis, cuya ultraestructura aún no ha sido bien estudiada. El objetivo de este trabajo fue conocer características ultraestructurales de células con fenotipo de células madre del cáncer de la línea celular MDA-MB-436 de tumor mamario triple negativo comparándolas con células madre adiposas. Se utilizó microscopía electrónica de barrido y de transmisión. Previamente, mediante separación inmunomagnética positiva empleando anticuerpos anti CD44 y anti CD24 unidos a perlas magnéticas, se obtuvo una población de células con fenotipo CD44alta/CD24baja a partir de 10x106 células de la línea MDA-MB-436, la cual igual que las células madre adiposas fue cultivada en cubreobjetos para microscopía electrónica de barrido; en tanto que para microscopía electrónica de transmisión se obtuvo un pellet de células, luego se fijó con glutaraldehído al 2,5 % y post fijó con OsO4 1 %. Para microscopía óptica de alta resolución se usó azul de toluidina como tinción. Luego de obtener el fenotipo de células madre del cáncer se corroboró su pluripotencia detectando la expresión de los genes Oct4 y nanog mediante RT-PCR. Nuestros resultados muestran que las células de este fenotipo son pequeñas, redondeadas, recubiertas por microvellosidades abundantes pero cortas; el citoplasma tiene organelas de secreción celular y abundantes mitocondrias alargadas; el núcleo es excéntrico ocupando la mitad del volumen celular, el nucléolo es voluminoso y la heterocromatina está adosada a la membrana nuclear interna. Se concluye que el inmunofenotipo celular estudiado es una sub población celular dentro de la línea estudiada que difiere en tamaño y ultraestructura de las células madre adiposas.

SUMMARY: Breast cancer is the leading cause of cancer deaths in women. Electron microscopy allows establishing constitutive characteristics of cells between different cell populations. CD44 high / CD24 low mammary cancer stem cells are a population of intratumoral cells associated with chemoresistance and metastasis, whose ultrastructure has not yet been well studied. The objective of this work was to know the ultrastructural characteristics of cells with cancer stem cell phenotype, of the triple negative mammary tumor cell line MDAMB-436 436 using scanning and transmission electron microscopy, and to contrast them with adipose-derived mesenchymal stem cells. Previously, by immunomagnetic purification using anti CD44 and anti CD24 antibodies bound to magnetic beads, cells populations was obtained from 10x106 cells of the MDA-MB-436 line, which, adipose-derived mesenchymal stem whereas cultivated on coverslips for scanning electron microscopy; while for transmission electron microscopy a cell pellet was obtained, then fixed with 2.5 % glutaraldehyde and post fixed with OsO4 1 %. For high resolution optical microscopy, toluidine blue was used as staining. After obtaining the phenotype of cancer stem cells, their pluripotency was corroborated by detecting the expression of the Oct4 and nanog genes by RT-PCR. Our results show that the cells of this phenotype are small, rounded, covered by abundant but short microvilli; the cytoplasm has organelles of cellular secretion and abundant elongated mitochondria; the nucleus is eccentric occupying half of the cellular volume, the nucleolus is bulky and the heterochromatin is attached to the inner nuclear membrane. It is concluded that the cellular immunophenotype studied is a sub-cellular population within the line studied that differs in size and ultrastructure of the adipose stem cells.